大家好，关于pcr方法很多朋友都还不太明白，不过没关系，因为今天小编就来为大家分享关于pcr检测主要是检测什么的知识点，相信应该可以解决大家的一些困惑和问题，如果碰巧可以解决您的问题，还望关注下本站哦，希望对各位有所帮助！

本文目录

1. pcr核质分离步骤
2. pcr荧光定量检测方法
3. pcr产物连接方式有哪些
4. 96孔pcr板手工使用方法
5. pcr反应体系配制详细操作过程

一、pcr核质分离步骤

1、核质分离是检测某种RNA或蛋白质在细胞质和细胞核中含量的一种方法，根据细胞膜和核膜溶解的难易用不同强度的裂解液溶解细胞，达到细胞质和细胞核物质分离的效果。分离的产物通过q-pcr或WB分别检测目的RNA或蛋白在细胞质和细胞核中的含量。

2、核质分离提取RNA用actin和U6的mRNA作为内参，actinmRNA基本位于细胞质中，U6mRNA基本位于细胞核。分离的RNA产物用actin和U6进行q-pcr检测，确定核质分离是否成功。

3、核质分离提取蛋白用Histone和GAPDH作为内参标准，Histone基本位于细胞核内，GAPDH基本位于细胞质中。分离提取的蛋白产物分别用Histone和GAPDH抗体进行WB检测核质分离分离是否成功。

二、pcr荧光定量检测方法

1、SYBRGreenI是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料。其与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。

2、SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。PCR扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法，40个循环。

三、pcr产物连接方式有哪些

1、PCR纯化产物直接连接通常分为两种情况，一是TA连接，如phusion,高保真的taq，PCR后会有一个A末端，和T载体的T末端互补相连。

2、另一是平末端连接，如pfu，PCR后是平末端，可以和bluntIIvector这一类的载体直接相连，但顺序是随机的，可能是正的，也可能是反的。

四、96孔pcr板手工使用方法

1.1.1.插上电源线（先连接PCR仪，再插入电源插座），打开主机及模块背面的开关，屏幕出现selftesting进度条，仪器开始自检，等待仪器完成自检。可进行下一步操作。

1.1.2.用功能键选择NEW或RUN，创建一个新程序或调出已有程序。1.1.3.抓住热盖前端的凹槽，先前下压，然后往上提起热盖。1.1.4.放入已经上完样并密封的PCR管或板。

1.1.5.盖上热盖，顺时针旋紧热盖上的旋钮，当热盖压力适合时，会发出齿轮刮擦的声音，此时停止旋紧。

1.1.6.可通过STATUS或TIME两个功能键查看程序运行状态。1.1.7.按CANCEL键可取消正在运行的程序，按PAUSE键可暂停运行。1.1.8.程序运行结束，选择MAIN可回到主菜单界面。

1.1.9.程序运行结束后，先逆时针旋松热盖，然后再按3中指示开盖取出样品。

五、pcr反应体系配制详细操作过程

试剂准备是PCR操作的第一个流程，需要在试剂贮存和准备区的超净工作台或生物安全柜进行，用确保无污染的移液器、枪头及容器等进行分装。所有的PCR体系都应该在-20℃保存，除了ddH2O之外，其余的试剂组份需完全融化之后再加入，以免影响浓度。配制反应体系应在快速进行，以减少非特异性扩增。体系配制完成之后应马上进行PCR反应。

样本制备是整个PCR反应中最为关键的环节，在接收样本时一定要确保样本的密封性以及样本编号的唯一性。严格遵守操作规程进行加样操作，操作时候尽量少说话或者不说话。

所有操作需要在生物安全柜内进行，操作前后生物安全柜需要进行紫外灯消毒，注意生物安全柜中物品的排放。戴手套并勤于更换，要有「无核酸观念」。

在核酸扩增环节需要选择质量好的Ep管，装入反应体系的EP管上机前混匀、离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。在样本检测的同时设立对照（阳性对照、阴性对照、阴性模板、试剂对照）。同时严密检测PCR扩增仪的各项性能指标，其中对PCR扩增仪而言温度控制就意味着质量。

1）无CT值出现：模板量不足（杂质的引入及反复冻融的情况等）

2）CT值出现过晚（大于38）：各种反应成分的降解或加样量的不足

3）标准曲线线性相关性不佳：加样误差、标准品出现降解等

4）阴性对照有信号：模板有基因组的污染

5）扩增效率低：反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解、反应抑制

6）扩增曲线的异常：模板的浓度太高或荧光染料的降解

1）各工作区要有一定的隔离，进入工作区域应按照单一的方向进行。试剂贮存和准备区→标本制备区→PCR扩增区→产物分析区单一方向进行。

2）各个区域实验用品专用：各个区域实验设备和物品应有明确的标记，不能混用。

3）实验场所要保持通风良好，严格监测各个工作区的温湿度。

整个PCR实验的操作都需要特别注意避免污染，来自样本的、试剂的以及实验室各种气溶胶，要始终保持「无核酸观念」。

关于pcr方法的内容到此结束，希望对大家有所帮助。